方案概述
前言：
嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，DON）及其乙?；苌?3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-ADON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-ADON），均由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生，是全球谷物中普遍存在的真菌毒素。三者均通過抑制蛋白質(zhì)合成干擾細胞功能，3-ADON 和 15-ADON 毒性更強、親脂性更高，三者還會干擾免疫功能。雖急性致癌性弱于黃曲霉毒素 B?，但因污染廣、協(xié)同危害大，被列為食品安全重點監(jiān)控對象，在小麥、玉米等谷物及制品中檢出率高，且常共存污染。?
這類毒素的污染多因谷物生長期低溫多雨或儲存時水分過高，導(dǎo)致鐮刀菌繁殖產(chǎn)毒。三者化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，常規(guī)加工難以破壞，且乙酰化衍生物可能轉(zhuǎn)化為 DON，加劇殘留風(fēng)險。人體攝入后，短期會出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛腹瀉等消化道癥狀，3-ADON 和 15-ADON 引發(fā)的癥狀更劇烈；長期低劑量攝入則持續(xù)損傷免疫功能，影響兒童生長發(fā)育，對孕婦、老人及免疫力低下人群危害更顯著。?
本應(yīng)用方案參考《GB 5009.111-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》對DON、3-ADON、15-ADON的檢測方法，依托皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，建立了三者的同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法可實現(xiàn)目標(biāo)物的精準(zhǔn)分離與同步定量，為食品中此類毒素的檢測提供可靠技術(shù)支持。
關(guān)鍵詞：真菌毒素；嘔吐毒素；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜。
1.儀器設(shè)備及試劑
1.1 儀器配置
表1 儀器配置清單表
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序號 |
名稱 |
數(shù)量 |
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1 |
LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng) |
1臺 |
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2 |
P3500B 二元高壓恒流泵 |
1臺 |
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3 |
CT3500 柱溫箱 |
1臺 |
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4 |
AS3500 超高效自動進樣器 |
1臺 |
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5 |
SmartLab CDS 2.0色譜工作站 |
1套 |
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6 |
C18 2.7 μm 2.1x100 mm |
1個 |
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7 |
SPE HLB（200mg/6mL)固相萃取柱 |
若干 |
1.2 試劑及標(biāo)準(zhǔn)品清單
表2 試劑及標(biāo)品清單表
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序列 |
試劑及標(biāo)準(zhǔn)品 |
純度 |
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1 |
甲醇 |
LC-MS級 |
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2 |
乙腈 |
LC-MS級 |
|
3 |
甲酸 |
LC-MS級 |
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4 |
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 |
100 ppm |
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5 |
3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 |
100 ppm |
|
6 |
15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 |
100 ppm |
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7 |
3-乙?；撗跹└牭毒┐?[¹³C??]（¹³C-3-ADON） |
25 ppm |
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8 |
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-[¹³C??]（¹³C-DON） |
25 ppm |
1.3 實驗材料及輔助設(shè)備
渦旋混合器；
高速離心機；
分析天平；
離心機；
固相萃取裝置（帶真空泵）；
氮吹儀；
搖床。
2.實驗方法
2.1 溶液配制
2.1.1 0.05%甲酸水溶液：取0.5mL甲酸加入到1000mL水中，混勻。
2.1.2 0.05%甲酸乙腈溶液：取0.5mL甲酸加入到1000mL乙腈中，混勻。
2.1.3 乙腈-水溶液(84+16)：量取160mL水加入到840mL乙腈中，混勻。
2.1.4 乙腈飽和的正己烷溶液：量取200mL正己烷于250mL分液漏斗中，加入少量乙腈，劇烈振搖數(shù)分鐘，靜置分層，棄去下層乙腈層即得。
2.1.5 甲醇-水溶液(5+95)：量取5mL甲醇加入到95mL水中，混勻。
2.2 樣本前處理
2.2.1 樣品提取
取小麥粉過2 mm孔徑試驗篩，稱取2ｇ試樣（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入800 μＬ同位素內(nèi)標(biāo)工作液（500 ng/mL)振蕩混合后靜置30 min。加入20 mL乙腈-水溶液(84+16)，渦旋混勻，搖床中振蕩20 min，在10000 r/min下離心5 min，取上清液備用。
2.2.2 樣品凈化
取5mL上清液置于50mL離心管中，加入10mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混合2min，5000r/min離心2min，棄去正己烷層后，于40 ℃~50 ℃下氮氣吹干，加入4mL水充分溶解殘渣，待凈化。將固相萃取柱連接到固相萃取裝置，先后用3mL甲醇和3mL水活化平衡。將4mL上述水復(fù)溶液上柱，控制流速為每秒1滴~2滴。用3mL水、1mL 5%甲醇-水溶液依次淋洗柱子后徹底抽干。用4mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液后在40℃~50℃下氮氣吹干。加入1.0mL初始流動相溶解殘留物，渦旋混勻10s，用0.22μm 微孔濾膜過濾于進樣瓶中，待進樣。
2.3 實驗條件
2.3.1 液相方法條件
色譜柱：C18 2.7 μm 2.1x100 mm；
流動相：A相： 0.05%甲酸水溶液；B相：0.05%甲酸乙腈溶液；
流速：0.35mL/min；
柱溫：40 ℃；
進樣體積：10 µL。
2.3.2 質(zhì)譜方法條件
表5 化合物質(zhì)譜參數(shù)
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化合物名稱 |
前體離子(m/z) |
產(chǎn)物離子(m/z) |
碰撞能量CE |
|
DON |
297.1 |
249.1* |
14 |
|
297.1 |
231.1 |
17 |
|
|
3-ADON |
339.1 |
231.1* |
18 |
|
339.1 |
203.1 |
25 |
|
|
15-ADON |
339.1 |
137.1* |
21 |
|
339.1 |
321.1 |
12 |
|
|
¹³C-DON |
312.1 |
263.1* |
14 |
|
312.1 |
245.1 |
15 |
|
|
¹³C-3-ADON |
356.1 |
245.1* |
20 |
注：帶*為定量離子
3.實驗結(jié)果
3.1 標(biāo)準(zhǔn)品譜圖
8分鐘內(nèi)完成DON、3-ADON、15-ADON、¹³C-DON、¹³C-3-ADON的檢測，如圖1 化合物峰有良好的峰形，其響應(yīng)良好，符合實驗測定需求。
圖1 DON、3-ADON、15-ADON、¹³C-DON、¹³C-3-ADON的色譜圖
3.2 線性范圍
準(zhǔn)確移取適量DON、3-ADON、15-ADON標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和¹³C-DON、¹³C-3-ADON混合同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液，用初始流動相配制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，DON、3-ADON、15-ADON線性范圍為5-640 ng/mL，其中包含100 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)，DON以¹³C-DON作為內(nèi)標(biāo)校正和3-ADON、15-ADON以¹³C-3-ADON作為內(nèi)標(biāo)校正后，DON、3-ADON、15-ADON線性結(jié)果與已知濃度的偏差小于最大允許偏差，R²均大于0.995，線性關(guān)系良好。
圖2 DON、3-ADON、15-ADON標(biāo)準(zhǔn)曲線
3.3 定量限與檢出限
本方法以5 ng/mL、10 ng/mL分別作為DON、3-ADON、15-ADON的檢出限和定量限，其信噪比如下表，檢出限信噪比均大于3，定量限信噪比均大于10。
表6 定量限與檢出限
|
化合物名稱 |
檢出限信噪比（5 ng/mL） |
定量限信噪比（10 ng/mL） |
|
DON |
8.9 |
16.35 |
|
3-ADON |
18.972 |
37.389 |
|
15-ADON |
59.148 |
108.855 |
3.4 重復(fù)性
取10、40、320 ng/mL三種濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進樣6針。結(jié)果如下表所示，高中低濃度 DON、3-ADON、15-ADON保留時間，樣品量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以內(nèi)，滿足實驗要求。
表7 高中低濃度 DON、3-ADON、15-ADON重復(fù)性測試
|
化合物 |
濃度(ng/mL) |
峰面積RSD（%） |
保留時間RSD（%） |
|
DON |
10 |
2.252 |
0.290 |
|
40 |
3.168 |
0.327 |
|
|
320 |
0.718 |
0.268 |
|
|
3-ADON |
10 |
1.807 |
0.153 |
|
40 |
1.718 |
0.179 |
|
|
320 |
1.292 |
0.135 |
|
|
15-ADON |
10 |
2.049 |
0.159 |
|
40 |
2.623 |
0.235 |
|
|
320 |
4.121 |
0.107 |
3.5 加標(biāo)回收
在樣品A中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，使DON、3-ADON、15-ADON濃度增加20 ng/mL，進液質(zhì)測試，連續(xù)6針進樣測試，回收率與RSD符合實驗要求。
表8 回收率
|
化合物 |
回收率 |
RSD |
|
DON |
98.81% |
3.37% |
|
ADON |
105.39% |
4.17% |
|
15-ADON |
116.11% |
2.19% |
3.6 空白殘留
在進樣640 ng/mL標(biāo)液后，進樣一針單空白（初始溶劑加內(nèi)標(biāo)），計算空白殘留，結(jié)果如圖3，空白殘留未檢出。
圖3 化合物空白色譜圖
3.7 樣品測定
樣品A（圖4）檢出DON含量為14.4 ng/g，未檢出3-ADON、15-ADON。
圖4 樣品A的 DON、3-ADON、15-ADON色譜圖
4.結(jié)論
本方法使用皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)建立嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，DON）及其乙?；苌?3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-ADON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-ADON）的同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測方法。由數(shù)據(jù)可得該方法的各色譜峰峰形良好、無拖尾，靈敏度符合國標(biāo)要求，R²均大于0.995，符合線性要求，高中低濃度的重復(fù)性在5%以內(nèi)，高濃度樣本無系統(tǒng)殘留，說明了該方法配備皖儀科技液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)滿足對待測樣本的常規(guī)性定性定量檢測需求。
相關(guān)產(chǎn)品
如需下載完整解決方案，請?zhí)顚懸韵滦畔ⅰ?
