安徽省首家科創(chuàng)板上市企業(yè) 股票代碼： 688600

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方案概述

前言：

亞硝胺雜質是一類具有亞硝基與胺結合（R1N(-R2)-N=O）的化學結構的化合物，具有高潛在致突變致癌性。多種藥品中相繼檢出小分子亞硝胺類雜質（如NDMA、NDEA、NDBA等）或與原料藥相關的亞硝胺類雜質（NDSRI），使得監(jiān)管機構和制藥企業(yè)對該類雜質一直高度關注。鹽酸普萘洛爾是一種非選擇性β腎上腺素受體阻滯劑，化學式為C₁₆H₂₂ClNO₂，CAS號為3506-09-0，分子量295.804，常溫下為白色或類白色結晶性粉末。其通過拮抗β1和β2受體降低心率、抑制心肌收縮及傳導，減少心肌耗氧量，臨床制劑包括片劑和注射液。鹽酸普萘洛爾片為非選擇性β-受體阻斷藥，阻斷心肌的β受體，對β1和β2受體均有拮抗作用。減慢心率，抑制心臟收縮力與傳導、循環(huán)血量減少、心肌耗氧量降低。臨床主要用于治療多種原因所致的心律失常，也可用于心絞痛高血壓嗜鉻細胞瘤（手術前準備）等，由于拮抗β2受體可引起支氣管痙攣和哮喘，故本品禁用于支氣管哮喘的病人。普萘洛爾因結構中含有仲胺，可能會產(chǎn)生相應的NDSRI雜質，推測其亞硝基雜質結構如下圖1，根據(jù)FDA發(fā)布的亞硝胺原料藥相關雜質推薦可接受攝入量控制指南中記載N-亞硝基-普萘洛爾AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值為1500ng/天。

圖1 普萘洛爾（上圖）與N-亞硝基-普萘洛爾（下圖）結構圖

亞硝胺雜質AI值為1500ng/天，結合鹽酸普萘洛爾片已批準說明書規(guī)定的最大日劑量200mg/天計算，控制限度為不得過7.5ppm。結合限度，開發(fā)了高效液相色譜法對鹽酸普萘洛爾片中的亞硝胺雜質進行測定，并且對方法采用皖儀科技高效液相色譜儀配置紫外檢測器進行相應的方法學驗證，包括：專屬性、線性、準確度、重復性、檢測限等，結果顯示該方法專屬、靈敏、可靠。

關鍵詞：普萘洛爾；高效液相色譜法；亞硝胺類雜質

1.儀器設備及試劑

1.1液相配置清單

表1 高效液相色譜系統(tǒng)配置清單

序號	名稱	數(shù)量
1	UV3400 紫外檢測器	1臺
2	P3400B 四元低壓恒流泵	1臺
3	CT3400 柱溫箱	1臺
4	AS3400 全自動進樣器	1臺
5	SmartLab NetCDS 色譜使用工作站	1套
6	C18 250x4.6 mm，5 μm	1個

1.2試劑及標準品清單

表2 試劑及標品清單表

序列	試劑及標準品	純度
1	乙腈	HPLC級
2	十二烷基硫酸鈉	AR級
3	磷酸二氫四丁基銨	AR級
4	氫氧化鈉	AR級
5	硫酸	AR級
4	N-亞硝基-普萘洛爾	99.85%

1.3實驗材料及輔助設備

超聲波清洗機；

渦旋混合器

2.實驗方法

2.1溶液配制

2.1.1 2mol/L氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉4g，加水50mL溶解，混勻，即得。

2.1.2乙腈-水-硫酸（55：45：0.1）的混合液：取十二烷基硫酸鈉1.6g與磷酸二氫四丁基銨0.31g，加入1mL硫酸、450mL水和550mL乙腈，用2mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH3.3，混勻，即得。

2.1.3溶劑：同流動相。

2.1.4 線性溶液：取N-亞硝基-普萘洛爾對照品適量，精密稱定加流動相溶解并稀釋至每1mL約含200ng的溶液，作為標準貯備液母液；然后精密量取標準貯備液適量分別置于6個100mL容量瓶中，加流動相定容至刻度線，搖勻，配制成濃度為0.8ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL和6ng/mL標準系列工作曲線。

2.1.5對照品溶液：取N-亞硝基-普萘洛爾對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋制成每1mL約含N-亞硝基-普萘洛爾2ng的溶液，作為對照品溶液。

2.2樣品配制

2.2.1 樣品溶液

精密稱取鹽酸普萘洛爾片細粉適量，用流動相溶解并稀釋制成每1mL約含普萘洛爾0.27mg的溶液，作為樣品溶液。

2.2.2 準確度溶液

取鹽酸普萘洛爾片細粉約297mg，精密稱定至100mL量瓶中，加入適量的N-亞硝基-普萘洛爾對照品溶液，用流動相溶解并稀釋至刻度，配制成100%加標樣品，搖勻，即得，作為準確度溶液。

3實驗結果

3.1專屬性

圖2 專屬性測試譜圖

說明：溶劑不干擾N-亞硝基-普萘洛爾檢測，供試品溶液中其他雜質色譜峰亦不干擾N-亞硝基-普萘洛爾雜質測定。

3.2線性測試

圖3 N-亞硝基-普萘洛爾雜質標準曲線圖

說明：實驗結果顯示，N-亞硝基-普萘洛爾雜質測試曲線相關系數(shù)R值在0.999以上，滿足試驗要求。

3.3 重復性測試

圖4 6針2ng/mL標準品重復性測試譜圖

表3 6針2ng/mL標準品重復性測試數(shù)據(jù)

化合物名	保留時間（min）	峰面積(mAU*s)
N-亞硝基-普萘洛爾	2.935	3.963
	2.934	3.979
	2.933	3.984
	2.932	3.964
	2.932	3.996
	2.932	3.944
平均值	2.933	3.972
RSD（%）	0.043	0.464

說明：由上表數(shù)據(jù)可知，N-亞硝基-普萘洛爾保留時間重復性為0.043%；峰面積重復性為0.464%，重復性良好。

3.4 準確度測試

圖5 片劑中N-亞硝基-普萘洛爾準確度疊加圖

表4 鹽酸普萘洛爾片準確度（N-亞硝基-普萘洛爾）

水平	已有量（ng）	加入量（ng）	測得量（ng）	回收率（%）	平均值（%）
100%	0.00	200.00	201.662	100.831	101.38
100%	0.00		197.331	98.666
100%	0.00		193.958	96.979
100%	0.00		206.093	103.046
100%	0.00		209.416	104.708
100%	0.00		208.157	104.079

說明：6份樣品中N-亞硝基-普萘洛爾的回收率在96.98~104.71%，平均回收率為101.38%，本方法檢測準確度及重復性良好。

3.5 檢測限測試

圖6 N-亞硝基-普萘洛爾濃度為2ng/mL對照品測試譜圖

表5 N-亞硝基-普萘洛爾濃度為2ng/mL對照品測試數(shù)據(jù)

名稱	保留時間(min)	峰面積(mAU*s)	信噪比
N-亞硝基-美托洛爾	2.946	3.994	39.689

說明：根據(jù)上表N-亞硝基-普萘洛爾濃度為2ng/mL對照品測試數(shù)據(jù)，3倍信噪比為檢測限計算可知N-亞硝基-普萘洛爾檢測限理論結果為0.151ng/mL。

3.6 某廠家片劑測試

圖7 某廠家片劑測試譜圖

說明：某廠家片劑中未檢測出N-亞硝基-普萘洛爾。

4．結論

根據(jù)FDA日前發(fā)布的藥物基質亞硝胺雜質（NDSRI，Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities）允許攝入量設定的指南文件對鹽酸普萘洛爾片劑中亞硝胺雜質N-亞硝基-普萘洛爾進行研究。根據(jù)該文件計算AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值為1500ng/天，同時結合本品最大日劑量（200mg），在片劑中的控制限度為不得過7.5ppm。采用皖儀科技高效液相色譜儀系列配置紫外檢測器進行相應的方法學驗證,用已驗證的檢測方法對片劑樣品進行檢測未檢出亞硝胺雜質N-亞硝基-普萘洛爾。以上數(shù)據(jù)均滿足藥典方法對于儀器的要求。