安徽省首家科創(chuàng)板上市企業(yè) 股票代碼： 688600

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皖儀科技LCMS-TQ9200測(cè)定雞肉中酰胺醇類(lèi)抗生素殘留，助力食品安全

方案概述

前言：

酰胺醇類(lèi)抗生素（Chloramphenicols，CAPs）是一類(lèi)具有廣譜抗菌活性的藥物，代表性藥物包括氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考。其核心藥理作用在于不可逆結(jié)合細(xì)菌核糖體50S亞基的肽酰轉(zhuǎn)移酶中心，阻斷肽鏈延伸，從而高效抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成（作用機(jī)制）。該特性使其對(duì)革蘭氏陰性菌（如沙門(mén)氏菌、大腸桿菌）及部分陽(yáng)性菌（如鏈球菌）均表現(xiàn)出顯著抑菌活性。在獸藥使用方面，因成本低廉、組織穿透力強(qiáng)（尤其對(duì)血腦屏障和血眼屏障），酰胺醇類(lèi)廣泛用于畜牧業(yè)，治療豬、牛以及禽類(lèi)的呼吸道疾?。ㄈ缲i胸膜肺炎、牛巴氏桿菌病）、消化道感染及神經(jīng)系統(tǒng)感染。然而，因其超范圍與超劑量用藥、忽視休藥期、代謝復(fù)雜性以及交叉污染等因素，獸藥殘留問(wèn)題日益嚴(yán)峻。殘留導(dǎo)致的健康危害具有遺傳毒性、肝腎損傷、耐藥性危機(jī)以及母嬰風(fēng)險(xiǎn)等多維風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)動(dòng)物源性食品中酰胺醇類(lèi)抗生素藥物殘留的檢測(cè)已成為獸藥研發(fā)以及食品安全控制中必不可少的重要環(huán)節(jié)。

我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 31650-2019食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定部分酰胺醇類(lèi)抗生素動(dòng)物源食品中的獸藥最大殘留量，其中氯霉素作為食品中禁止檢出藥物；同時(shí)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 31658.20-2022 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中酰胺醇類(lèi)藥物及其代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中規(guī)定了4種酰胺醇類(lèi)液質(zhì)檢測(cè)方法。本應(yīng)用方案成功驗(yàn)證了皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)滿(mǎn)足雞肉中4種酰胺醇類(lèi)抗生素殘留的檢測(cè)方法要求。

關(guān)鍵詞：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；酰胺醇；食品安全；獸藥殘留

1.儀器設(shè)備及試劑

1.1液相串聯(lián)質(zhì)譜配置清單

表1 儀器配置清單表

序號(hào)	名稱(chēng)	數(shù)量
1	LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)	1臺(tái)
2	P3600B 二元高壓恒流泵	1臺(tái)
3	CT3600 柱溫箱	1臺(tái)
4	AS3600 超高效自動(dòng)進(jìn)樣器	1臺(tái)
5	SmartLab CDS 2.0色譜使用工作站	1套

1.2試劑及標(biāo)準(zhǔn)品清單

表2 試劑及標(biāo)品清單表

序列	試劑及標(biāo)準(zhǔn)品	純度
1	甲醇	LC-MS級(jí)
2	乙腈	LC-MS級(jí)
3	甲酸	LC-MS級(jí)
4	氨水	分析純
5	乙酸乙酯	分析純
6	正己烷	分析純
7	氯化鈉	分析純
8	氟苯尼考胺	99%
9	氟苯尼考胺-D3	99%
10	氯霉素	99%
11	氯霉素-D5	99%
12	甲砜霉素	99%
13	甲砜霉素-D3	99%
14	氟苯尼考	99%
15	氟苯尼考-D3	99%

1.3實(shí)驗(yàn)材料及輔助設(shè)備

超聲波清洗機(jī)；

渦旋混合器；

水浴氮吹儀；

高速離心機(jī)。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1溶液配制

2.1.1 2%氨化乙酸乙酯溶液：取氨水4 mL，用乙酸乙酯稀釋到200 mL。

2.1.2 4%氯化鈉溶液：取氯化鈉4 g，用水溶解并稀釋到100 mL。

2.1.3 4%氯化鈉飽和的正己烷溶液：取適量的4%氯化鈉溶液，加入過(guò)量的正己烷，混合，靜置分層，取上層正己烷。

2.1.4 混合內(nèi)標(biāo)工作液：取適量的混合內(nèi)標(biāo)母液，20%甲醇稀釋到氯霉素-D5 10 ng/mL，其他內(nèi)標(biāo)（氟苯尼考-D3、甲砜霉素-D3和氟苯尼考胺-D3）為50 ng/mL。

2.2樣本前處理

2.2.1樣本提取

稱(chēng)取樣品2 g(準(zhǔn)確至±0.01g)，加混合內(nèi)標(biāo)工作液100 µL，渦旋1 min，渦旋混勻，加2%氨化乙酸乙酯溶液10 mL，渦旋震蕩10 min，8000 rpm離心5 min，取上清液，殘?jiān)?%氨化乙酸乙酯溶液10 mL，重復(fù)上述步驟提取一遍。合并兩次上清液，于50℃氮?dú)獯蹈桑瑐溆谩?/span>

2.2.2樣本凈化

取凈化殘?jiān)?%氯化鈉溶液3 mL渦旋使其溶解，再加4%氯化鈉飽和的正己烷溶液5 mL，渦旋30 s，8000 rpm離心5 min，棄去上層正己烷層，再重復(fù)脫脂一次。加2%氨化乙酸乙酯溶液5 mL，渦旋震蕩10 min，8000 rpm離心5 min，取上清液，殘?jiān)?%氨化乙酸乙酯溶液5 mL，重復(fù)上述步驟提取一遍。合并上清液，于50℃氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇溶液1 mL渦旋30s，過(guò)濾膜，待上機(jī)。

2.3實(shí)驗(yàn)條件

2.3.1液相方法條件

色譜柱：C18 1.7μm 2.1x50mm

流動(dòng)相：A相：乙腈；B相：2 mM甲酸銨水

流速：0.3 mL/min

柱溫：40 ℃

進(jìn)樣體積：5 µL

2.3.2質(zhì)譜方法條件

表3 質(zhì)譜離子源參數(shù)

離子源	參數(shù)
離子源電壓	ESI+5000 V/ -4000 V
脫溶劑氣流速	15000 mL/min
霧化氣流速	2000 mL/min
氣簾氣流速	5000 mL/min
碰撞氣流速	800 μL/min
脫溶劑氣溫度	500 ℃
氣簾氣溫度	150 ℃

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1標(biāo)準(zhǔn)品譜圖

6分鐘內(nèi)完成4種酰胺醇抗生素及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，各峰均有良好的峰形，無(wú)峰形拖尾現(xiàn)象，各化合物響應(yīng)良好，符合實(shí)驗(yàn)測(cè)定需求。

圖1 4種酰胺醇類(lèi)抗生素及內(nèi)標(biāo)色譜圖

（氯霉素 0.2 ng/mL,其他抗生素1 ng/mL）

3.2線(xiàn)性范圍

取適量酰胺醇類(lèi)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋到系列濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性范圍氯霉素0.2-10 ng/mL，氟苯尼考胺、甲砜霉素和氟苯尼考1-50 ng/mL，線(xiàn)性檢測(cè)結(jié)果與已知濃度的偏差小于最大允許偏差，R²范圍在0.9958~0.9998之間，各組分線(xiàn)性關(guān)系良好。

表4各化合物線(xiàn)性范圍表

化合物	線(xiàn)性范圍	回歸方程	線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R²
氟苯尼考胺	1-50 ng/mL	Y=0.215X-0.005	0.9998
氯霉素	0.2-10 ng/mL	Y=3.476X+0.112	0.9994
甲砜霉素	1-50 ng/mL	Y=1.150X-0.055	0.9958
氟苯尼考	1-50 ng/mL	Y=0.2658X+0.2175	0.9978

圖2 4種化合物線(xiàn)性結(jié)果

3.3檢測(cè)限與定量限

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31658.20-2022中規(guī)定本方法氯霉素的檢測(cè)限為0.1µg/kg，定量限為0.2 µg/kg；甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的檢測(cè)限為0.5 µg/kg，定量限為1 µg/kg。本方法中各化合物在檢測(cè)限與定量限規(guī)定濃度下信噪比遠(yuǎn)大于3和10，符合國(guó)標(biāo)中靈敏度要求。

表5 各化合物檢測(cè)限與定量限

化合物	信噪比（S/N）
化合物	檢測(cè)限	定量限
氟苯尼考胺	33.30	71.43
氯霉素	66.91	185.57
甲砜霉素	74.32	257.56
氟苯尼考	136.55	386.17

圖3 4種化合物檢測(cè)限與定量限色譜圖

3.4精密度測(cè)試

取低中高三種濃度酰胺醇類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針比較保留時(shí)間與峰面積偏差，結(jié)果如下表所示，所有酰胺醇類(lèi)化合物保留時(shí)間偏差均小于1%，峰面積偏差均小于5%，符合國(guó)標(biāo)的RSD≤15%的精密度要求。

表6 各化合物精密度測(cè)試

化合物	濃度(ng/mL)	保留時(shí)間偏差RSD(%，n=6)	峰面積偏差 RSD(%，n=6)
氟苯尼考胺	2	0.65	1.72
	5	0.75	1.40
	10	0.65	1.08
甲砜霉素	2	0.20	3.31
	5	0.25	4.84
	10	0.31	4.39
氟苯尼考	2	0.29	4.01
	5	0.29	4.26
	10	0.18	4.39
氯霉素	0.4	0.28	3.18
	1	0.18	2.51
	2	0.25	2.48

圖4 4種酰胺醇類(lèi)化合物精密度色譜圖

3.5基質(zhì)加標(biāo)回收率測(cè)試

采用加標(biāo)回收試驗(yàn)評(píng)估該檢測(cè)項(xiàng)目的正確度：測(cè)定各檢測(cè)指標(biāo)的濃度，將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品按不同比例加到空白基質(zhì)樣品中進(jìn)行前處理，制作高、中、低三個(gè)不同濃度的基質(zhì)加標(biāo)樣品。每個(gè)濃度的加標(biāo)樣品獨(dú)立測(cè)定6次，通過(guò)檢測(cè)加標(biāo)前后基質(zhì)中的濃度，計(jì)算回收率，評(píng)估該項(xiàng)目的準(zhǔn)確度。結(jié)果如下所示：雞肉基質(zhì)中各化合物加標(biāo)回收率在94.5-107.2%之間，CV在5%以?xún)?nèi)，準(zhǔn)確度符合方法要求。

表6 雞肉基質(zhì)中各化合物加標(biāo)回收率

化合物	加標(biāo)量(ng/mL)	測(cè)得量（ng/mL）	平均回收率（%，n=6）	CV（%，n=6）
氟苯尼考胺	2	2.04	101.80	3.92
	5	4.99	99.83	1.20
	10	9.45	94.48	3.41
甲砜霉素	2	2.01	100.54	4.05
	5	5.16	103.15	2.53
	10	9.76	97.60	4.44
氟苯尼考	2	2.02	100.96	2.84
	5	5.25	105.00	2.47
	10	10.72	107.23	1.82
氯霉素	0.4	0.41	102.00	2.85
	1	1.02	101.82	3.96
	2	2.09	104.28	4.54

3.6樣品測(cè)試

公司附近超市隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)雞胸肉樣品，經(jīng)上述樣品前處理方法提取、凈化，樣品上機(jī)測(cè)試，4種酰胺醇類(lèi)抗生素均未檢出。

圖5 超市雞胸肉樣品中4種酰胺醇類(lèi)化合物色譜圖

4結(jié)論

本方法使用皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，進(jìn)行動(dòng)物源食品中酰胺醇類(lèi)抗生素的測(cè)定，正負(fù)離子模式化合物可同時(shí)采集。由數(shù)據(jù)可得該方法的各色譜峰峰形良好、無(wú)拖尾，靈敏度符合國(guó)標(biāo)要求，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，連續(xù)6針各化合物保留時(shí)間偏差在1%以?xún)?nèi)，峰面積偏差均在5%以?xún)?nèi)，精密度良好；雞肉基質(zhì)加標(biāo)回收率在94.5-107.2%之間，CV在5%以?xún)?nèi)，準(zhǔn)確度符合方法要求；超市隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)雞胸肉樣品，上機(jī)測(cè)試4種酰胺醇類(lèi)抗生素均未檢出。說(shuō)明了該方法配備皖儀科技液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)滿(mǎn)足對(duì)待測(cè)樣本的常規(guī)性定性定量檢測(cè)需求。