方案概述

前言：

對(duì)羥基苯甲酸酯類（尼泊金酯類）作為一類高效、廣譜的防腐劑，廣泛應(yīng)用于食品（如醬油、醋、飲料、果醬等）、化妝品及醫(yī)藥領(lǐng)域，其抑菌效果與安全性直接關(guān)系到產(chǎn)品的穩(wěn)定性和消費(fèi)者健康。該類物質(zhì)包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、異丙酯、異丁酯及庚酯等7種常見(jiàn)衍生物，其抗菌活性隨酯基碳鏈增長(zhǎng)而增強(qiáng)，且在pH 4-8范圍內(nèi)均能保持穩(wěn)定效果，成為酸性防腐劑的重要替代品。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸酯類可能具有潛在的雌激素活性，長(zhǎng)期攝入或接觸可能與內(nèi)分泌干擾效應(yīng)相關(guān)，部分異構(gòu)體（如異丙酯、異丁酯）的毒性甚至高于直鏈同系物。盡管其在體內(nèi)代謝迅速（通過(guò)水解為對(duì)羥基苯甲酸后經(jīng)尿液排出），但環(huán)境殘留問(wèn)題逐漸顯現(xiàn)，如在水體和土壤中難降解的特性可能引發(fā)生態(tài)累積風(fēng)險(xiǎn)。

本次實(shí)驗(yàn)參考《GB 5009.31-2025 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對(duì)羥基苯甲酸脂類化合物的測(cè)定》，采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3500系列配置DAD檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，系統(tǒng)適用性測(cè)試，各化合物峰型良好，理論塔板數(shù)高，滿足實(shí)驗(yàn)要求；連續(xù)進(jìn)樣6次濃度為1.0mg/L對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，保留時(shí)間重復(fù)性均在0.2%以下，峰面積重復(fù)性均在1.0%以下，重復(fù)性良好；在0.2~50mg/L范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，線性良好；加標(biāo)樣品中7種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的回收率在97.6~104.8%之間，準(zhǔn)確度良好；試樣測(cè)試未檢出7種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物。以上數(shù)據(jù)均滿足標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)于儀器的要求。

關(guān)鍵詞：食品添加劑；對(duì)羥基苯甲酸酯類；尼泊金酯類；高效液相色譜。

1.儀器設(shè)備及試劑

1.1高效液相色譜配置清單

表1 儀器配置清單表

序號(hào)	名稱	數(shù)量
1	LC3500液相色譜系統(tǒng)	1臺(tái)
2	P3500B 雙三元梯度泵	1臺(tái)
3	CT3500 柱溫箱	1臺(tái)
4	AS3500 自動(dòng)進(jìn)樣器	1臺(tái)
5	DAD3500 檢測(cè)器	1臺(tái)
6	SmartLab CDS 2.0色譜使用工作站	1套
7	Nova Atom C18柱3μm 4.6x150mm	1個(gè)

1.2試劑及標(biāo)準(zhǔn)品清單

表2 試劑及標(biāo)品清單表

序列	試劑及標(biāo)準(zhǔn)品	純度
1	甲醇	色譜純
2	乙腈	色譜純
3	對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物混標(biāo)（1000mg/L）	/
4	磷酸	分析純

1.3實(shí)驗(yàn)材料及輔助設(shè)備

分析天平；

超聲波清洗機(jī)；

渦旋混合器

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1試劑配制

2.1.1 對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物混標(biāo)適量，用30%甲醇水稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.1.2 樣品前處理：稱取5g(精確至0.01g)試樣于50 mL刻度離心管內(nèi)(碳酸飲料需在超聲波清洗器中超聲脫氣 10min再稱樣)，加入甲醇-水溶液(3+7)30mL，渦旋3min，超聲20min，再加入甲醇-水溶液(3+7)至 40mL，6000r/min離心3min，過(guò)濾上清液，取濾液待凈化。分別用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，將待凈化的溶液轉(zhuǎn)入已活化的固相萃取柱中，依次用5mL水和5mL甲醇-水溶液(3+7)淋洗，用6mL甲醇洗脫，收集洗脫液，加水定容至10mL，過(guò)濾膜，供高效液相色譜儀測(cè)定。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1系統(tǒng)適用性測(cè)試

圖1 對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)試色譜圖

表3 對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)試結(jié)果

化合物	保留時(shí)間(min)	理論塔板數(shù)	分離度
對(duì)羥基苯甲酸甲酯	11.558	15943	15.276
對(duì)羥基苯甲酸乙酯	16.575	52038	13.497
對(duì)羥基苯甲酸異丙酯	21.167	47190	2.161
對(duì)羥基苯甲酸丙酯	22.008	51205	13.168
對(duì)羥基苯甲酸異丁酯	27.692	54566	1.566
對(duì)羥基苯甲酸丁酯	28.267	189191	11.862
對(duì)羥基苯甲酸庚酯	30.792	552047	n.a.

系統(tǒng)適用性測(cè)試顯示：各峰峰型良好，理論塔板數(shù)高，周圍無(wú)雜峰干擾，分離度均大于1.5以上，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

3.2重復(fù)性測(cè)試

圖2 1.0mg/L對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物6針重復(fù)性測(cè)試譜圖

表4 1.0mg/L對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物6針重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

化合物	保留時(shí)間RSD（%）	峰面積RSD（%）
對(duì)羥基苯甲酸甲酯	0.129	0.286
對(duì)羥基苯甲酸乙酯	0.090	0.127
對(duì)羥基苯甲酸異丙酯	0.110	0.145
對(duì)羥基苯甲酸丙酯	0.111	0.136
對(duì)羥基苯甲酸異丁酯	0.108	0.708
對(duì)羥基苯甲酸丁酯	0.129	0.239
對(duì)羥基苯甲酸庚酯	0.037	0.901

重復(fù)性測(cè)試顯示：連續(xù)進(jìn)樣6次濃度為1.0mg/L對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，保留時(shí)間重復(fù)性均在0.2%以下；峰面積重復(fù)性均在1.0%以下，重復(fù)性良好。

3.3線性測(cè)試

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試譜圖

線性測(cè)試顯示：在0.2~50mg/L范圍內(nèi)，7種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)均＞0.9999，線性良好。

3.4準(zhǔn)確度測(cè)試

圖4 準(zhǔn)確度測(cè)試譜圖

表5 對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物準(zhǔn)確度測(cè)試結(jié)果

水平	已有量（μg/mL）	加入量（μg/mL）	測(cè)得量（μg/mL）	回收率（%）
對(duì)羥基苯甲酸甲酯	0.0	1.0	1.029	102.9
對(duì)羥基苯甲酸乙酯			1.034	103.4
對(duì)羥基苯甲酸異丙酯			1.031	103.1
對(duì)羥基苯甲酸丙酯			1.031	103.1
對(duì)羥基苯甲酸異丁酯			1.028	102.8
對(duì)羥基苯甲酸丁酯			0.976	97.6
對(duì)羥基苯甲酸庚酯			1.048	104.8

準(zhǔn)確度測(cè)試顯示：加標(biāo)樣品中7種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的回收率在97.6~104.8%之間，準(zhǔn)確度良好。

3.5某品牌飲料測(cè)試

圖5 某品牌飲料測(cè)試譜圖

樣品測(cè)試顯示：某品牌飲料中未檢測(cè)出7種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物。

4.結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)參考《GB 5009.31-2025 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對(duì)羥基苯甲酸脂類化合物的測(cè)定》，采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3500系列配置DAD檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，系統(tǒng)適用性測(cè)試，各化合物峰型良好，理論塔板數(shù)高，滿足實(shí)驗(yàn)要求；連續(xù)進(jìn)樣6次濃度為1.0mg/L對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，保留時(shí)間重復(fù)性均在0.2%以下，峰面積重復(fù)性均在1.0%以下，重復(fù)性良好；在0.2~50mg/L范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，線性良好；加標(biāo)樣品中7種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物的回收率在97.6~104.8%之間，準(zhǔn)確度良好；試樣測(cè)試未檢出7種對(duì)羥基苯甲酸酯類化合物。以上數(shù)據(jù)均滿足標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)于儀器的要求。